Als je net bent afgestudeerd en aan het werk bent gegaan, word je geconfronteerd met een aantal zelfstandige naamwoorden die te maken hebben met real-time kwantitatieve PCR-experimenten. Weet je niet waar je moet beginnen? Wat is de betekenis van amplificatiecurve, standaardcurve, drempel, CT-waarde, smeltcurve en basislijn? De fluorescerende beelden van die experimenten zijn te helder, maar ik kan ze niet identificeren. Vandaag nemen we je mee om deze kennis en concepten in twee delen te leren: technische termen en veelgestelde vragen.
Deel I Beroepsvoorwaarden
1. Versterkingscurve
De amplificatiecurve verwijst naar de curve waarbij het cyclusnummer de abscis is en de real-time fluorescentie-intensiteit tijdens de reactie de ordinaat is tijdens de PCR.
2. Basislijn
Baseline verwijst naar weinig verandering in fluorescentiesignaal tijdens de eerste paar cycli van een PCR-amplificatiereactie. Het signaalniveau wordt bijna een rechte lijn weergegeven, wat de basislijn is.
3. Instelling fluorescentiedrempel
Gewoonlijk wordt het fluorescentiesignaal van de eerste 15 cycli van de PCR-reactie gebruikt als het fluorescentie-achtergrondsignaal en is de fluorescentiedrempel 10 keer de standaarddeviatie van het fluorescentiesignaal tijdens 3-15 cycli van PCR, en de fluorescentiedrempel wordt ingesteld tijdens de exponentiële fase van PCR-amplificatie. Normaal gesproken heeft elk instrument zijn eigen fluorescentiedrempel vóór gebruik.
4. CT-waarde
De CT-waarde vertegenwoordigt het aantal cycli dat voor elke PCR-reactiebuis zal plaatsvinden wanneer het fluorescerende signaal de ingestelde drempel bereikt. Uit onderzoek weten we dat er een lineair verband bestaat tussen de CT-waarde van elk sjabloon en de logaritme van het startkopienummer van dat sjabloon. Hoe hoger het oorspronkelijke kopienummer, hoe kleiner de CT-waarde en vice versa. Met behulp van standaarden met bekende startkopienummers kan een kalibratiecurve worden gemaakt waarbij de abscis de logaritme van het startkopienummer vertegenwoordigt, terwijl de ordinaat de CT-waarde vertegenwoordigt. Daarom kan, zolang de CT-waarde van het onbekende monster wordt verkregen, het eerste kopienummer van het monster worden berekend op basis van de standaardcurve.
meer weten
Er zijn verschillende indicatoren om te beoordelen of de versterkingscurve goed is of niet:
Antwoord: Het buigpunt van de curve is duidelijk, vooral de exponentiële fase van het monster met een lage zware fractie is duidelijk, de algehele parallelliteit van de amplificatiecurve is erg goed, de basislijn is vlak, er is geen stijgend fenomeen en de versterking curve van het low-level exponentiële faseconcentratiemonster is erg goed. overduidelijk.
B: De helling van de exponentiële fase van de curve is recht evenredig met de versterkingsefficiëntie, hoe groter de helling, hoe hoger de versterkingsefficiëntie.
C: De standaardbasislijn is vlak of licht dalend, zonder duidelijke opwaartse trend.
D: De parallelliteit van de amplificatiecurven voor elke buis is goed, wat aangeeft dat de amplificatie-efficiëntie van elke reageerbuis vergelijkbaar is.
5. Smeltkromme
Wanneer het PCR-product wordt verwarmd en de temperatuur stijgt, dissocieert het dubbelstrengs amplificatieproduct geleidelijk, wat resulteert in een afname van de fluorescentie-intensiteit. Bij het bereiken van een bepaalde temperatuur scheidt zich een grote hoeveelheid product af, waardoor de fluorescentie sterk afneemt. Het gebruik van deze functie in combinatie met verschillende TM-waarden voor verschillende PCR-producten verschilt ook in de temperatuur waarbij het fluorescentiesignaal snel afneemt, wat een goede manier kan zijn om PCR-specificiteit te identificeren.
6. Smeltcurve (met behulp van logaritmische curve)
De piekgrafiek wordt gevormd door de logaritme van de smeltkromme om de situatie van productfragmenten intuïtiever weer te geven. Aangezien de smelttemperatuur de TM-waarde van een DNA-fragment is, kunnen bepaalde parameters die van invloed zijn op de TM-waarde van een DNA-fragment worden bepaald, zoals fragmentgrootte, GC-gehalte, enz. Over het algemeen wordt er volgens ons primerontwerpprincipe meestal gezegd dat de lengte van het versterkte product in het bereik van 80-300bp ligt en dat de smelttemperatuur tussen 80 graden en 90 graden moet liggen.
A: Als er slechts één hoofdpiek is tussen 80 graden en 90 graden, betekent dit dat de real-time PCR perfect is.
B: Als de hoofdpiek tussen 80 graden en 90 graden verschijnt en de onzuiverheidspiek onder 80 graden verschijnt, wordt in principe het primer-dimeer beschouwd. Dit is een goede optie om te proberen op te lossen door de gloeitemperatuur te verhogen.
C: Als de hoofdpiek verschijnt tussen 80 graden en 90 graden, en een zwervende piek verschijnt wanneer de temperatuur stijgt, wordt in feite DNA-besmetting beschouwd. En het DNA moet in de beginfase van het experiment worden verwijderd.
7. Standaard curvelijn
Standaardstandaarden werden verdund tot verschillende concentraties en gebruikt als templates voor PCR-reacties. De standaardkromme wordt uitgezet met de logaritme van het standaardkopienummer als abscis en de gemeten CT-waarde als ordinaat. Bij het kwantificeren van een onbekend monster kan het kopienummer van het monster worden verkregen uit de standaardcurve op basis van de CT-waarde van het onbekende monster. Standaardcurven zijn erg belangrijk voor absolute kwantificering.
het tweede gedeelte. vaak voorkomend probleem
V1: Wat is het verschil tussen RT-PCR, QPCR, real-time PCR en real-time RT-PCR?
A1: RT-PCR is reverse transcriptie-PCR, een veelgebruikte variant van de polymerasekettingreactie. Bij RT-PCR wordt de RNA-streng omgekeerd getranscribeerd in complementair DNA, dat vervolgens wordt gebruikt als een sjabloon voor PCR om het DNA door middel van PCR te amplificeren.
Real-time PCR en QPCR zijn hetzelfde, beide zijn real-time kwantitatieve PCR, wat betekent dat er tijdens elke cyclus tijdens het PCR-proces real-time gegevens worden vastgelegd. Op deze manier kan het aantal startup-sjablonen nauwkeurig worden geanalyseerd.
Hoewel zowel real-time PCR als reverse-transcriptie-PCR lijken te worden afgekort als RT-PCR, is de internationale conventie dat RT-PCR specifiek verwijst naar reverse-transcriptie-PCR, terwijl real-time PCR vaak wordt afgekort als qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR) - tijd PCR).
Real-time RT-PCR (RT-QPCR) is een type reverse transcriptie-PCR die fluorescerende kwantitatieve technieken combineert: eerst reverse transcriptie van RNA om cDNA (RT) te verkrijgen, gevolgd door kwantitatieve analyse met behulp van real-time PCR (QPCR).
V2: Waarom wordt de lengte van het geamplificeerde productfragment van fluorescerende kwantitatieve PCR gecontroleerd binnen het bereik van 80-300bp?
A2: De lengte van elke gensequentie is verschillend, sommige zijn enkele Kb en honderden BP. Wanneer we echter de primer ontwerpen, hoeven we alleen te eisen dat de lengte van het product 80-300bp is, en te kort of te lang is niet geschikt voor kwantitatieve PCR-detectie.
Productfragmenten zijn te kort om te onderscheiden van primer-dimeren. De lengte van het primer-dimeer is ongeveer 30-40bp, wanneer het minder dan 80 bp is, is het moeilijk te onderscheiden of het een primer-dimeer of een product is. Als het productfragment te lang is, meer dan 300 bp, zal dit gemakkelijk leiden tot een lage amplificatie-efficiëntie en kan de hoeveelheid gen niet effectief worden gedetecteerd.
Als je bijvoorbeeld het aantal mensen in een klas telt, hoef je alleen maar te tellen hoeveel monden er zijn. Hetzelfde geldt voor het testen van genen. Je hoeft alleen maar een bepaalde sequentie van een gen te detecteren om de hele sequentie weer te geven. Het is gemakkelijk om een fout te maken als je zowel monden als neuzen, oren en brillen telt om mensen te tellen.
Vraag 3: Wat is de optimale lengte voor het ontwerp van de primer?
A3: Over het algemeen zijn primerlengtes in het bereik van 20-24bp goed. Natuurlijk moeten we bij het ontwerpen van de primer letten op de TM-waarde van de primer, omdat deze gerelateerd is aan de optimale gloeitemperatuur. Na veel experimenteren is bewezen dat 60 graden een goede TM-waarde is. Een lage annealingstemperatuur kan gemakkelijk leiden tot niet-specifieke amplificatie, terwijl een hoge annealingstemperatuur meestal leidt tot een lage amplificatie-efficiëntie, een late piek van de amplificatiecurve en een vertraagde CT-waarde.
Vraag 4: Heeft de hoeveelheid verzameld monster invloed op de experimentele resultaten?
A4: Nee. Het is duidelijk dat hoe meer monsters worden verzameld, hoe meer RNA wordt geëxtraheerd, hoe meer cDNA en hoe meer doelfragmenten er zullen zijn. Voor absolute kwantificering is het noodzakelijk om het aantal kopieën van het doelfragment te berekenen, en de hoeveelheid verzameld monster zal zeker de experimentele resultaten beïnvloeden. De detectie van hepatitis C-virus HBV in het bloed is bijvoorbeeld het detecteren van het HBV-gehalte in een bepaalde hoeveelheid (1 ml) bloed.
Voor relatieve kwantificering die vaak wordt gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, heeft het aantal monsters niets te maken met de experimentele resultaten, omdat relatieve kwantificering verwijst naar de vergelijking tussen het doelgen en het referentiegen. Beschouw ze alsjeblieft als stroomopwaartse en stroomafwaartse fragmenten die aanwezig zijn in dezelfde nucleïnezuurstreng. Als de steekproefomvang groot is, worden zowel referentie- als doelgenen tegelijkertijd in gelijke verhoudingen verhoogd, wat geen invloed heeft op de resultaten.
V5: Zal de efficiëntie van reverse transcriptase de experimentele resultaten beïnvloeden?
A5: Zelfde als hierboven. Merk op dat we een hogere RT-efficiëntie willen, maar we geven er de voorkeur aan dat het RT-enzym relatief stabiel is en uniforme resultaten verkrijgt. Dit zal een test zijn van de geoptimaliseerde mogelijkheden van de reverse transcriptiesuites van de grote bedrijven.
Vraag 6: Heeft de efficiëntie van het TAQ-enzym invloed op de experimentele resultaten?
A6: De efficiëntie van het TAQ-enzym is relatief groot. Typisch zijn hot-start taq-enzymen vereist en deze zijn relatief efficiënt. Voor commerciële fluorescentie-kwantitatieve kits zal elke fabrikant de efficiëntie van de beste staat optimaliseren volgens zijn eigen producten tot bijna 100 procent, als de efficiëntie te laag is, kunnen de experimentele resultaten niet worden verkregen. Voor de producten van verschillende bedrijven is dit een kwaliteitsmaatstaf.
Vraag 7: Heeft de hoeveelheid fluorescerende kleurstof invloed op de experimentele resultaten?
A7: Ja, dat zal het. Als het fluorochroom te verzadigd is, kan dit bij sommige instrumenten ruisinterferentie veroorzaken. Als het fluorochroom niet verzadigd is en de fluorescentiewaarde te laag is, zal het vroegtijdig een plateaufase ingaan en zal de amplificatiecurve vlak zijn. In het kwantitatieve fluorescentie-experiment wordt voornamelijk de CT-waarde gezien, dus het is niet belangrijk dat de late amplificatiecurve het plateaustadium ingaat, maar het beeld is niet mooi genoeg. Als je moet kiezen, begin dan met het kiezen van een fluorochroom dat iets minder verzadigd is. Bij gebruik van hetzelfde product van hetzelfde bedrijf is het effect echter in principe te verwaarlozen.
Vraag 8: Zal de transmissie van de PCR-buis de experimentele resultaten beïnvloeden?
A8: Ja. Voor dezelfde partij verbruiksartikelen van dezelfde fabrikant kan dit effect echter worden genegeerd. Dit is een goede keuze en het is het beste om een 96-well-plaat met een membraan met hoge doorlaatbaarheid te gebruiken om het effect van de lichtdoorlatendheid van de verbruiksartikelen te minimaliseren.
V9: Zullen fouten tijdens het gebruik de experimentele resultaten beïnvloeden?
A9: De invloed van het bedrijfsproces komt vooral tot uiting in de uniformiteit. Homogeniteit betekent dat alle componenten in het systeem gelijkmatig met elkaar vermengd zijn, en flitscentrifugatie kan dit probleem oplossen. Bovendien is het voor beginners het beste om het PCR-systeem aan te passen tot meer dan 20 inch, en een te klein systeem is meer vatbaar voor fouten. Als de gloeitemperatuur correct is geoptimaliseerd, wordt het effect van primerconcentratie op CT geminimaliseerd. En u weet dat sommige operationele fouten (zoals primerconcentratie) kunnen worden vermeden door de gloeitemperatuur te optimaliseren.
Samenvatten
Bovenstaande zijn enkele vragen en vragen die beginners vaak tegenkomen tijdens het experiment, we hopen dat deze vragen je kunnen helpen om wat verwarring op te lossen. Experimenteren is het proces van het genereren van chaos en het oplossen van problemen, hopelijk haal je er iets uit. Bedankt voor het lezen en we zien je de volgende keer!
