Wat is celcultuur?
cel cultuur
Celkweek verwijst naar het proces van het kweken van cellen onder gecontroleerde omstandigheden buiten hun natuurlijke omgeving. Het is een in vitro hulpmiddel dat het begrip van celbiologie en ziektemechanismen vergemakkelijkt. Het speelt ook een rol bij het ontdekken van geneesmiddelen, zoals het testen van de toxiciteit van geneesmiddelen en farmacokinetische/farmacodynamische studies, evenals gepersonaliseerde geneeskunde.
De Amerikaanse embryoloog Ross Granville Harrison ontwikkelde de eerste in vitro celkweektechnieken in het begin van de 20e eeuw, toen hij met succes weefselfragmenten uit kikkerembryo's in vitro kweekte. Tegenwoordig heeft celkweek talloze ontdekkingen gedaan, zoals de ontwikkeling van vaccins tegen polio, mazelen, bof en andere infectieziekten.
Adhesie- en suspensiecultuur
Er zijn twee basissystemen voor celgroei: hechtende cultuur en suspensiecultuur. Hechtende culturen worden gekweekt op kunstmatige substraten, terwijl cellen in suspensieculturen vrij in het medium drijven. Hoewel slechts een paar celtypen van nature in suspensie groeien (bijv. lymfocyten), kunnen veel aanhangende celtypen worden aangepast aan suspensiekweek.
Er zijn twee redenen om natuurlijk hechtende cellen in suspensie te kweken. Het eerste voordeel van suspensiecultuur is dat cellen gemakkelijker kunnen worden gepasseerd omdat u ze niet enzymatisch of mechanisch hoeft te scheiden van het kweekvat. Ten tweede zijn suspensieculturen gemakkelijker op te schalen omdat celgroei alleen wordt beperkt door hun concentratie in het medium, niet door het beschikbare oppervlak. Het grootste nadeel van suspensieculturen is dat ze dagelijkse celtellingen en levensvatbaarheidstesten vereisen om groeipatronen te volgen, terwijl hechtende culturen gemakkelijk onder een microscoop kunnen worden onderzocht.
2D- en 3D-methoden
Hechtende culturen kunnen verder worden onderverdeeld in 2D- en 3D-culturen. In 2D-toepassingen worden hechtende cellen gekweekt in een monolaagsysteem op een plat oppervlak, zoals in een celkweekkolf.
cel cultuur
Vanwege zijn eenvoud kan 2D-technologie de in vivo omgeving van cellen niet nabootsen, die typisch groeien in driedimensionale structuren met complexe cel-tot-cel-interacties. Dit is de reden waarom sommige experimenten worden uitgevoerd met behulp van 3D-culturen die kunnen worden gekweekt met behulp van scaffold-gebaseerde of scaffold-vrije technologieën.
Op steigers gebaseerde 3D-methoden omvatten meestal het kweken van hechtende cellen in hydrogelsteigers. Voor sommige toepassingen worden ook alternatieven gebruikt, zoals steigers van biokeramiek, metaal of polymeer.
Scaffold-vrije technieken worden gebruikt om sferoïden te laten groeien op een van de drie verschillende manieren:
Forced Float: Laad de celsuspensie in de putjes van een met polymeer gecoate microplaat met lage hechting. De microplaat wordt vervolgens gecentrifugeerd om de cellen te dwingen sferoïden te vormen.
Hangende druppel: De celsuspensie wordt geladen in de putjes van een hangende druppelplaat. Zoals de naam al doet vermoeden, zal de suspensie als druppels op de plaat hangen. Cellen zullen zich verzamelen aan de uiteinden van deze druppeltjes en bollen vormen.
Op basis van agitatie: de celsuspensie wordt in een roterende bioreactor geplaatst. Door de constante agitatie konden de cellen zich niet aan de wanden hechten en vormden ze sferoïden.
Celcultuur-uitdaging
Ondanks de verschillen in methoden en technieken hebben alle experimenten één ding gemeen: het is moeilijk om levende cellen in de vereiste aantallen te laten groeien om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Daarom zullen de volgende paragrafen gewijd zijn aan vier uitdagingen: herhaalbaarheid, besmetting, haalbaarheid en de overgang naar automatisering.
reproduceerbaarheid
Volgens een onderzoek van Yongyue Medical meldde meer dan 70 procent van de wetenschappers dat ze de experimenten van een andere wetenschapper niet konden reproduceren, en meer dan de helft slaagde er niet in hun eigen werk te reproduceren. Bij celkweekassays komen de meeste reproduceerbaarheidsproblemen voort uit biologische verschillen tussen celpassages of generaties. Een ander groot probleem is de verkeerde identificatie van cellijnen, en ook inconsistenties in kweekparameters spelen een belangrijke rol.
biologische variatie
Factoren zoals willekeurige mutaties of transcriptiefouten kunnen de reproduceerbaarheid van experimenten beïnvloeden telkens wanneer een cel zich deelt. Om dit te voorkomen, moet u aan het begin van een nieuw project een celbank maken.
mobiele bank
Celbankieren verwijst naar het proces van het opslaan van batches van specifieke celtypen voor later gebruik om factoren zoals willekeurige mutaties of transcriptiefouten die de reproduceerbaarheid beïnvloeden te vermijden. De eerste stap is het opzetten van een mastercelbank (MBC) door geselecteerde celtypen die van belang zijn voor kweek te laten groeien en ze in meerdere containers te cryoconserveren. MBC-batches worden ontdooid en later gebruikt om werkende celbanken (WBC's) voor te bereiden.
Verkeerde identificatie van cellijnen
Het probleem van verkeerde identificatie van cellijn is bekend sinds de jaren zestig, toen een wetenschapper HeLa-celbesmetting van 19 andere menselijke cellijnen beschreef. Om ervoor te zorgen dat uw resultaten betrouwbaar zijn en, nog belangrijker, om geen valse conclusies te trekken, moet u alle nieuwe cellijnen die het laboratorium binnenkomen in quarantaine plaatsen totdat hun oorsprong is geverifieerd. Het belangrijkste is dat het wordt aanbevolen om de cellijnkwalificatie te herhalen voorafgaand aan cryopreservatie en distributie naar andere laboratoria en nadat het project is voltooid. Om een cellijn te verifiëren, moet u eerst controleren of deze in het verkeerd geïdentificeerde cellijnregister staat. Als het niet is geregistreerd, moet u nog steeds de authenticiteit ervan bevestigen. Voor menselijke cellijnen wordt short tandem repeat (STR)-analyse (DNA-fingerprinting) aanbevolen. Er zijn verschillende testmethoden beschikbaar voor niet-menselijke cellijnen, waaronder karyotypering, iso-enzymanalyse en mitochondriale DNA-typering (DNA-barcodering).
Cultuur parameters
Een derde factor die de reproduceerbaarheid beïnvloedt, zijn kweekparameters.
Zuurstofniveaus kunnen bijvoorbeeld gekweekte cellen aanzienlijk beïnvloeden. Variabelen die de oxygenatie beïnvloeden, zoals kamergrootte of celdichtheid, worden echter niet altijd gedocumenteerd en kunnen daarom niet consistent worden gehouden.
Een andere belangrijke cultuurparameter is het medium. Dit zorgt voor essentiële voedingsstoffen, groeifactoren en hormonen, en reguleert de pH en osmotische druk. Daarom is het belangrijkste dat de samenstelling altijd hetzelfde is. Dit is vooral van cruciaal belang voor middelgrote formuleringen aangevuld met foetaal runderserum (FBS), waarvan de samenstelling afhangt van factoren zoals het dieet van de koe, de geografische locatie en de tijd van het jaar. Om het effect van FBS op de reproduceerbaarheid van resultaten tot een minimum te beperken, dient u verschillende batches serum te bestellen wanneer de huidige voorraden opraken en deze te testen om de beste match te vinden. Om anderen uw resultaten te laten reproduceren, moet u rapporteren hoe u het serum hebt gescreend en het lotnummer noteren.
cel cultuur
Cel verwerking
De meeste onderzoekers weten dat cultuurparameters een enorme impact hebben op hun toepassingen, maar veranderingen in verwerkingstechnieken worden vaak over het hoofd gezien.
Vervuiling
Wanneer cellen uit weefsel worden geïsoleerd en in het laboratorium worden gekweekt, worden ze niet langer beschermd door het immuunsysteem en zijn ze daarom uiterst kwetsbaar voor besmetting.
De eerste bron van besmetting zijn abiotische verontreinigingen zoals onzuiverheden in kweekmedium, serum, supplementen of water, evenals endotoxinen en uitloogbare stoffen. Voorzorgsmaatregelen omvatten het gebruik van water van laboratoriumkwaliteit voor celkweekexperimenten en media, serum, supplementen en verbruiksartikelen van fabrikanten die certificering voor endotoxinetesten aanbieden. Bovendien moeten verbruiksartikelen gemaakt zijn van nieuw polystyreen of polypropyleen om ervoor te zorgen dat plastic additieven niet in uw celcultuur sijpelen.
De tweede besmettingsbron zijn biologische verontreinigingen zoals bacteriën (waaronder mycoplasma), schimmels en gisten.
geschiktheid
Cellevensvatbaarheid wordt gedefinieerd als het aandeel levensvatbare cellen in een monster. Naast de verontreinigingen die we zojuist hebben gezien, zijn er verschillende andere factoren die de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden. Omgevingsomstandigheden - temperatuur, pH, osmotische druk, beschikbaarheid van voedingsstoffen en O2- en CO2-concentraties - zijn erg belangrijk. De meeste van deze variabelen worden gecontroleerd door het medium en zijn celtypespecifiek, wat helaas betekent dat we geen specifieke richtlijnen kunnen geven.
Aangezien cellen erg gevoelig zijn voor druk, moet u niet alleen letten op de omgevingsomstandigheden, maar ook op uw vloeistofbehandelingstechnieken.
Een laatste factor die de levensvatbaarheid van cellen beïnvloedt, is senescentie. De meeste eindige cellijnen overleven 20 tot 60 delingen voordat ze sterven, wat betekent dat ze alleen tussen 15 en 45 generaties kunnen worden hergebruikt. Daarna moet het gecryopreserveerde monster uit de celbank worden ontdooid. Continue cellijnen kunnen zich onbeperkt vermenigvuldigen, maar omdat ze vatbaar zijn voor genetische drift, moeten ze regelmatig worden vervangen.
Detectieassays met behulp van colorimetrische, fluorometrische en bioluminescente methoden kunnen worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten. Een veelgebruikte colorimetrische methode is de MTT-methode, die is gebaseerd op de reductie van gele tetrazoliumzouten tot paarse formazankristallen door levende cellen.
96-well-platen
automatisering
Veel van de hierboven beschreven uitdagingen kunnen worden aangepakt door workflows voor celkweek te automatiseren. De behandeling van cellen zal bijvoorbeeld altijd consistent zijn, wat een positieve invloed heeft op de reproduceerbaarheid en levensvatbaarheid. Het belangrijkste is dat automatisering het risico op gebruikersbesmetting verkleint.
Ondanks deze voordelen kan het automatiseren van volledige workflows een uitdaging zijn vanwege budgetredenen, gebrek aan ruimte voor robots of omdat er niet genoeg middelen zijn om elke stap in één keer te automatiseren en te valideren. Maar dit is op te lossen!
