PCR-technologie moet op kunstmatige wijze redelijke primers hebben gesynthetiseerd en monster-DNA hebben geëxtraheerd, en vervolgens automatische thermische cycli moeten uitvoeren en ten slotte productidentificatie en -analyse moeten uitvoeren. Op dit moment kunnen primerontwerp en -synthese alleen worden uitgevoerd in een paar onderzoeksinstituten, instituten en klinieken met een sterke technische sterkte. De applicatie hoeft alleen de PCR-detectiekit aan te schaffen om het werk te starten. Er zijn veel beïnvloedende factoren in de PCR automatische thermische cyclus. Voor verschillende DNA-monsters zijn de hoeveelheid verschillende componenten die in de PCR-reactie worden toegevoegd en de parameters van de temperatuurcyclus niet consistent.
Enkele belangrijke beïnvloedende factoren worden nu als volgt geïntroduceerd.
Eén, temperatuurcyclusparameters:
In de automatische thermische cyclus van PCR is de meest kritische factor de temperatuur van denaturatie en annealing. Zoals getoond in het operatievoorbeeld, zijn de condities van denaturatie, annealing en verlenging: 94-60s, 37-60s, 72-120s, een totaal van 25-30 A cyclus, het geamplificeerde fragment is 500 bp. Hier moet de tijd van elke stap worden berekend nadat het reactiemengsel de vereiste temperatuur heeft bereikt. In de automatische thermische cycler duurt de tijd van de oorspronkelijke temperatuur van het mengsel tot de vereiste temperatuur 30-60s. De lengte van deze vertragingstijd hangt af van verschillende factoren, waaronder het type reactiebuis, wanddikte, volume van het reactiemengsel, warmte bron (waterbad of verwarmingsblok), en het temperatuurverschil tussen de twee stappen, dat voldoende moet worden voorzien bij het instellen van de thermische cyclus. Let op en overweeg, en daadwerkelijke meting moet worden uitgevoerd op elk instrument.
Een andere belangrijke overweging over de thermische cyclustijd is de afstand tussen de twee primers; hoe verder de afstand, hoe langer het duurt om de volledige lengte van de doelsequentie te synthetiseren. De hierboven gegeven reactietijd is gebaseerd op de optimale syntheselengte van 500 bp. De doelsequentie wordt opgesteld. Hier is een inleiding tot de selectie van verschillende temperaturen.
1. Template denaturatietemperatuur De denaturatietemperatuur bepaalt de temperatuur waarbij het dubbelstrengs DNA smelt in de PCR-reactie. Als de denaturatietemperatuur niet wordt bereikt, wordt er geen enkelstrengs DNA-template geproduceerd en start de PCR niet. Lage denaturatietemperatuur betekent onvolledige denaturatie, dubbelstrengs DNA. Het zal snel renatureren, waardoor de opbrengst afneemt. Over het algemeen 90～95℃. Zodra het monster deze temperatuur heeft bereikt, moet het snel worden afgekoeld tot de gloeitemperatuur. DNA-denaturatie duurt slechts enkele seconden en is lange tijd niet nodig; integendeel, je moet je best doen bij hoge temperaturen. Verkort het om de activiteit van Taq DNA-polymerase te behouden. De maximale denaturatietemperatuur na toevoeging van Taq DNA-polymerase mag niet hoger zijn dan 95 °C.
2. Primer annealing temperatuur De annealing temperatuur bepaalt de specificiteit en opbrengst van PCR; als de temperatuur hoog is, is de specificiteit sterk, maar als de temperatuur te hoog is, kan de primer niet stevig worden gecombineerd met de matrijs en wordt de efficiëntie van DNA-amplificatie verminderd; de temperatuur is laag, de opbrengst is hoog, maar te laag kan leiden tot een mismatch van primer en template. Niet-specifieke producten nemen toe. Begin in het algemeen met de reactieconditie van 37℃, zet een reeks controlereacties op om de optimale gloeitemperatuur voor een specifieke reactie te bepalen. Het kan ook worden afgeleid op basis van het (G+C)% gehalte van de primers om de test te begrijpen. Het uitgangspunt van de algemene test, de gloeitemperatuur Ta (gloeitemperatuur) is 5℃ lager dan de smelttemperatuur TTm (smelttemperatuur) van de amplificatieprimer, die kan worden berekend volgens de formule:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Onder hen vertegenwoordigen A, T, G en C respectievelijk het aantal overeenkomstige basen. Bijvoorbeeld, voor een primer van 20 basen, als het gehalte van (G+C)% 50% is, kan het startpunt van Ta worden ingesteld op 55°C. Bij een typische primerconcentratie (zoals 0,2 mol/L) kan de uitgloeireactie in enkele seconden worden voltooid en is langdurig uitgloeien niet nodig.
3. De keuze van de primerverlengingstemperatuur hangt af van de optimale temperatuur van Taq-DNA-polymerase. Over het algemeen kan 70～75℃, de standaardsnelheid van door enzym gekatalyseerde nucleotiden bij 72℃ 35～100 nucleotiden/sec bereiken. per minuut. De lengte van 1 kb kan worden verlengd en de snelheid is afhankelijk van de samenstelling van de bufferoplossing, pH-waarde, zoutconcentratie en de aard van de DNA-template. Als het geamplificeerde fragment korter is dan 150 bp, kan de verlengingsstap worden weggelaten en wordt het een dubbele temperatuurcyclus vanwege Taq-DNA. Het polymerase is voldoende om de synthese van korte sequenties bij de annealingstemperatuur te voltooien. Voor fragmenten met een korte sequentie tussen 100 en 300 bp is het effectief om een snelle en eenvoudige cyclus met twee temperaturen te gebruiken. Op dit moment is de primerverlengingstemperatuur hetzelfde als de annealingstemperatuur. Voor DNA-fragmenten van meer dan 1 kb kan de verlengingstijd binnen 1 tot 7 minuten worden geregeld, afhankelijk van de lengte van het fragment. Tegelijkertijd moet gelatine of BSA-reagens aan de PCR-buffer worden toegevoegd om de Taq-DNA-polymerase gedurende lange tijd actief en stabiel te houden. Seks; 15%-20% glycerol helpt om DNA-fragmenten van ongeveer 2,5 kb of langer te amplificeren.
4. Het aantal cycli van conventionele PCR is over het algemeen 25 tot 40 cycli. De algemene fout is dat het aantal cycli te veel is, de niet-specifieke achtergrond ernstig is en de complexiteit toeneemt. Natuurlijk is het aantal cycli van de reactie te klein en is de opbrengst laag. Daarom is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het product wordt verkregen. Onder de premisse van snelheid, moet het aantal cycli worden geminimaliseerd.
Nadat de amplificatie is voltooid, wordt het monster afgekoeld en bewaard bij 4°C.
2. Primer Primer-ontwerp
Om template-DNA te amplificeren, moet u eerst twee oligonucleotide-primers ontwerpen. De zogenaamde primers zijn eigenlijk twee oligonucleotidefragmenten die complementair zijn aan de te amplificeren doel-DNA-sequentie. De afstand tussen de twee primers bepaalt de lengte van het geamplificeerde fragment. , De 5'uiteinden van de twee primers bepalen de posities van de twee 5'uiteinden van het geamplificeerde product. Het kan worden gezien dat de primers de sleutel zijn voor het bepalen van de lengte, positie en resultaten van de PCR-geamplificeerde fragmenten, en het primerontwerp is belangrijker.
De noodzakelijke voorwaarde voor primerontwerp is dat de doel-DNA-sequentie die complementair is aan de primer bekend moet zijn. De volgorde tussen de twee primers is niet noodzakelijk duidelijk. De twee bekende sequenties zijn over het algemeen 15-20 basen, die kunnen worden gesynthetiseerd met een DNA-synthesizer. Overeenkomend met twee complementaire primers, omvatten de principes die over het algemeen worden gevolgd bij het ontwerpen van primers:
1. De lengte van de primer wordt berekend volgens statistieken en de kans dat een oligonucleotidesequentie van ongeveer 17 basen in het menselijk genoom kan voorkomen, is één keer. Daarom is de primerlengte in het algemeen niet minder dan 16 nucleotiden, en de hoogste niet meer dan 30 nucleotiden, en de beste lengte is 20-24 nucleotiden. Dergelijke korte oligonucleotiden zullen bij de polymerisatietemperatuur (langer dan 72 °C) geen stabiele hybride vormen. Soms kan het op 5' zijn; Voeg sequenties toe die aan het einde niet complementair zijn aan de sjabloon, zoals restrictie-enzymplaatsen of promotors, om genklonering en andere speciale behoeften te voltooien; het primer 5'end biotinelabel of fluorescerend label kan voor verschillende doeleinden worden gebruikt, zoals microbiële detectie.
Soms werkt de primer' niet, de reden is onbekend, je kunt de positie verplaatsen om het op te lossen.
2. De samenstelling van primers met een (G+C)%-gehalte moet uniform zijn en probeer te voorkomen dat ze hetzelfde basispolymeer bevatten. Het (G+C)%-gehalte in de twee primers moet zo gelijk mogelijk zijn, in het bekende geamplificeerde fragment (G+C)%-gehalte moet in het algemeen dicht bij het te amplificeren fragment liggen 40% tot 60% is beter.
3. De binnenkant van de primer moet de vorming van duidelijke secundaire structuren vermijden, vooral haarspeldstructuren. Bijvoorbeeld:
4. Er mag geen complementatie zijn tussen de twee primers tussen de primers, vooral aan het 3'uiteinde van de primer. Zelfs als het niet kan worden vermeden, mag de 3'eind complementaire base niet groter zijn dan 2 basen, anders is het gemakkelijk om een & quot;primer dimeer" Of"Primer dimeer" (Primerdimeer). Het zogenaamde primerdimeer is in wezen een dubbelstrengs DNA-fragment gevormd door verlenging van de ene primer op de andere primersequentie onder de werking van DNA-polymerase. , Is een veel voorkomend bijproduct van PCR en wordt soms zelfs het hoofdproduct.
Vermijd bovendien homologe sequenties tussen de twee primers, in het bijzonder oligonucleotidefragmenten met meer dan 6 opeenvolgende identieke basen, anders zullen de twee primers met elkaar concurreren om dezelfde plaats van de matrijs; evenzo kunnen de primers en het te amplificeren doelwit-DNA of andere sequenties van het DNA-monster geen homologe sequenties van meer dan 6 basen hebben. Anders zullen de primers aan andere plaatsen binden, waardoor specifieke amplificatie wordt verminderd en niet-specifieke amplificatie wordt verhoogd.
5. Primer 3'end pairing DNA-polymerase voegt een enkele nucleotide toe aan het 3'-uiteinde van de primer. Daarom moeten de paringsvereisten van 5-6 basen van het 3'-uiteinde van de primer en het doel-DNA nauwkeurig en strikt zijn om effectieve PCR-amplificatie te garanderen. .
Of het ontwerp van de primer redelijk is, kan worden geverifieerd door op de computer te zoeken met behulp van PCRDESN-software en Amerikaanse PRIMER-software.
Kunstmatig gesynthetiseerde oligonucleotiden moeten bij voorkeur worden gezuiverd door middel van chromatografie (chromatografie) of PAGE om onzuiverheden te verwijderen, zoals korte ketens die niet tot volledige lengte zijn gesynthetiseerd. Gezuiverde primers bewaard in 25% acetonitriloplossing bij 4°C kunnen micro-organismen voorkomen. Onder normale omstandigheden dienen ongebruikte primers in een koelkast bij -20°C te worden bewaard. De primers kunnen 6 maanden in vloeistof worden bewaard en kunnen na vriesdrogen 1 tot 2 jaar worden bewaard.